|
|
Studium interakcí proteinkinasy CaMKK2 s kalmodulinem pomoci fluorescenční spektroskopie.
Mikulů, Martina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Ca2+ /kalmodulin-dependentní proteinkinasy jsou členy významné CaMK rodiny, která se účastní CaMK kaskády. Jedním z nich je Ca2+ /kalmodulin-dependentní proteinkina- sakinasa 2 (CaMKK2), která je aktivována vazbou komplexu Ca2+ /CaM. CaMKK2 se od většiny ostatních proteinkinas liší zejména strukturou v blízkosti αE-helixu a auto- inhibiční domény. Protože se autoinhibiční doména překrývá s Ca2+ /CaM-vazebnou doménou, lze před- pokládat, že vazba kalmodulinu způsobuje strukturní změny v oblastech interagujících s autoinhibiční doménou a ovlivňuje přístupnost těchto oblastí pro jiné molekuly. Pro ověření tohoto předpokladu byl exprimován a vypurifikován mutant CaMKK2 W445F, v jehož sekvenci se nachází pouze jeden tryptofanový zbytek na pozici 374, který se nachází v blízkosti sledované oblasti helixu αE. Strukturní změny v této oblasti byly pozorovány prostřednictvím zhášení intenzity fluorescence tryptofanového zbytku Trp374 prostřednictvím akrylamidu.Tato měření mohou poskytnout informaci o přístupnosti sle- dované oblasti. Porovnání zhášení fluorescence v přítomnosti a nepřítomnosti kalmodu- linu naznačilo, že při interakci CaMKK2 s kalmodulinem dochází ve sledované oblasti v blízkosti Trp374 ke...
|
|
|
Studium mechanismů regulace vybraných proteinkinas
Petrvalská, Olívia
Proteiny 14-3-3 skrze vazbu více než 300 vazebných partnerů regulují značné množství biologicky významných dějů, např. apoptosu, buněčný cyklus, přenos signálu či metabolické dráhy. V rámci této disertační práce byla studována úloha proteinů 14-3-3 v regulaci dvou vybraných proteinkinas ASK1 a CaMKK2. Hlavním cílem práce bylo pochopit strukturní podstatu mechanismů, kterými fosforylace a vazba proteinů 14-3-3 regulují aktivitu těchto proteinkinas pomocí různých biochemických a biofyzikálních metod, zejména metod bodové mutagenese, měření enzymové aktivity, analytické ultracentrifugace, maloúhlového rozptylu rentgenového záření, chemického zesítění, nukleární magnetické rezonance a fluorescenční spektroskopie. Na základě získaných dat z maloúhlového rozptylu rentgenového záření a chemického zesítění byl navrhnut model struktury komplexu katalytické domény proteinkinasy ASK1 s proteinem 14-3-3ζ, který ukazál, že tento komplex je v roztoku konformačně heterogenní. Tento strukturní model společně s daty z časově rozlišené fluorescence a nukleární magnetické rezonance částečně vysvětlují inhibiční mechanismus proteinu 14-3-3. Získané výsledky ukázaly, že protein 14-3-3ζ interaguje s katalytickou doménou ASK1 v těsné blízkosti aktivního místa, a proto by tato interakce mohla mít vliv na strukturu nebo...
|
|
|
Studium mechanismů regulace vybraných proteinkinas
Petrvalská, Olívia
Proteiny 14-3-3 skrze vazbu více než 300 vazebných partnerů regulují značné množství biologicky významných dějů, např. apoptosu, buněčný cyklus, přenos signálu či metabolické dráhy. V rámci této disertační práce byla studována úloha proteinů 14-3-3 v regulaci dvou vybraných proteinkinas ASK1 a CaMKK2. Hlavním cílem práce bylo pochopit strukturní podstatu mechanismů, kterými fosforylace a vazba proteinů 14-3-3 regulují aktivitu těchto proteinkinas pomocí různých biochemických a biofyzikálních metod, zejména metod bodové mutagenese, měření enzymové aktivity, analytické ultracentrifugace, maloúhlového rozptylu rentgenového záření, chemického zesítění, nukleární magnetické rezonance a fluorescenční spektroskopie. Na základě získaných dat z maloúhlového rozptylu rentgenového záření a chemického zesítění byl navrhnut model struktury komplexu katalytické domény proteinkinasy ASK1 s proteinem 14-3-3ζ, který ukazál, že tento komplex je v roztoku konformačně heterogenní. Tento strukturní model společně s daty z časově rozlišené fluorescence a nukleární magnetické rezonance částečně vysvětlují inhibiční mechanismus proteinu 14-3-3. Získané výsledky ukázaly, že protein 14-3-3ζ interaguje s katalytickou doménou ASK1 v těsné blízkosti aktivního místa, a proto by tato interakce mohla mít vliv na strukturu nebo...
|
|
|
Studium mechanismů regulace vybraných proteinkinas
Petrvalská, Olívia ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Jiráček, Jiří (oponent) ; Schneider, Bohdan (oponent)
Proteiny 14-3-3 skrze vazbu více než 300 vazebných partnerů regulují značné množství biologicky významných dějů, např. apoptosu, buněčný cyklus, přenos signálu či metabolické dráhy. V rámci této disertační práce byla studována úloha proteinů 14-3-3 v regulaci dvou vybraných proteinkinas ASK1 a CaMKK2. Hlavním cílem práce bylo pochopit strukturní podstatu mechanismů, kterými fosforylace a vazba proteinů 14-3-3 regulují aktivitu těchto proteinkinas pomocí různých biochemických a biofyzikálních metod, zejména metod bodové mutagenese, měření enzymové aktivity, analytické ultracentrifugace, maloúhlového rozptylu rentgenového záření, chemického zesítění, nukleární magnetické rezonance a fluorescenční spektroskopie. Na základě získaných dat z maloúhlového rozptylu rentgenového záření a chemického zesítění byl navrhnut model struktury komplexu katalytické domény proteinkinasy ASK1 s proteinem 14-3-3ζ, který ukazál, že tento komplex je v roztoku konformačně heterogenní. Tento strukturní model společně s daty z časově rozlišené fluorescence a nukleární magnetické rezonance částečně vysvětlují inhibiční mechanismus proteinu 14-3-3. Získané výsledky ukázaly, že protein 14-3-3ζ interaguje s katalytickou doménou ASK1 v těsné blízkosti aktivního místa, a proto by tato interakce mohla mít vliv na strukturu nebo...
|
|
|
Studium interakcí proteinkinasy CaMKK2 s kalmodulinem pomoci fluorescenční spektroskopie.
Mikulů, Martina ; Obšil, Tomáš (vedoucí práce) ; Pavlíček, Jiří (oponent)
Ca2+ /kalmodulin-dependentní proteinkinasy jsou členy významné CaMK rodiny, která se účastní CaMK kaskády. Jedním z nich je Ca2+ /kalmodulin-dependentní proteinkina- sakinasa 2 (CaMKK2), která je aktivována vazbou komplexu Ca2+ /CaM. CaMKK2 se od většiny ostatních proteinkinas liší zejména strukturou v blízkosti αE-helixu a auto- inhibiční domény. Protože se autoinhibiční doména překrývá s Ca2+ /CaM-vazebnou doménou, lze před- pokládat, že vazba kalmodulinu způsobuje strukturní změny v oblastech interagujících s autoinhibiční doménou a ovlivňuje přístupnost těchto oblastí pro jiné molekuly. Pro ověření tohoto předpokladu byl exprimován a vypurifikován mutant CaMKK2 W445F, v jehož sekvenci se nachází pouze jeden tryptofanový zbytek na pozici 374, který se nachází v blízkosti sledované oblasti helixu αE. Strukturní změny v této oblasti byly pozorovány prostřednictvím zhášení intenzity fluorescence tryptofanového zbytku Trp374 prostřednictvím akrylamidu.Tato měření mohou poskytnout informaci o přístupnosti sle- dované oblasti. Porovnání zhášení fluorescence v přítomnosti a nepřítomnosti kalmodu- linu naznačilo, že při interakci CaMKK2 s kalmodulinem dochází ve sledované oblasti v blízkosti Trp374 ke...
|
host ::
RSS.